技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

在動(dòng)物育種中，人們期望通過對(duì)生長(zhǎng)、繁殖等性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。

分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。

基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個(gè)體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美國(guó)麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90％以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1％時(shí)才被稱為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有：顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。

根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類：基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs,iSNPs)。

研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少?；蚓幋a區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種：一種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會(huì)影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。

由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs：即DNA序列測(cè)定方法、聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)與DNA測(cè)序結(jié)合法、等位特異性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來說可實(shí)施性不強(qiáng)。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment LengthPolymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后設(shè)計(jì)上下游引物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無特殊性要求。

KITLG(KIT Ligand，KL或KitL)是一種分泌生長(zhǎng)因子，又被稱為干細(xì)胞因子(StemCell Factor，SCF)，肥大細(xì)胞因子(Mast Stem Cell Factor，MCGF)或Steel因子(SteelFactor，SLF)，屬于酪氨酸激酶受體家族。KITLG由Mgf cDNA編碼，由284個(gè)氨基酸組成。KITLG mRNA主要在卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá))。KITLG通過其受體KIT信號(hào)影響卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的相互作用。顆粒細(xì)胞中的KITLG和卵母細(xì)胞中的KIT之間的互作對(duì)動(dòng)物繁殖是不可或缺的。KITLG在原始生殖細(xì)胞(Primordial Germ Cells，PGCs)的生存、增殖、遷移以及卵泡的發(fā)育中發(fā)揮作用。KITLG在卵泡發(fā)育中也起很重要的作用。KITLG結(jié)合KIT誘發(fā)PI3K通路在其它多種信號(hào)通路協(xié)調(diào)下傳導(dǎo)信息，激活卵母細(xì)胞，促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和分泌作用。雖然有關(guān)KITLG基因在動(dòng)物繁殖方面的作用的研究取得了一些進(jìn)展，但是在綿羊上的研究報(bào)道較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)綿羊KITLG基因的單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，利用PCR-RFLP方法針對(duì)其基因位點(diǎn)上的突變進(jìn)行檢測(cè)，提前淘汰劣勢(shì)個(gè)體，加快高繁種羊群體的建立。

技術(shù)負(fù)責(zé)人： 樂祥鵬  草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院