技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及綿羊單核苷酸多態(tài)性(SNP)分子標(biāo)記的篩選與檢測(cè)，特別涉及利用PCR-SSCP方法快速檢測(cè)NELF基因組第454位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。具體來(lái)說(shuō)，就是對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物變性之后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后根據(jù)電泳結(jié)果確定其單核苷酸多態(tài)性。

背景技術(shù)

近20年來(lái)，尤其是近10年來(lái)，分子遺傳學(xué)和分子生物技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，其中，分子遺傳標(biāo)記是目前在家畜育種中研究得最多的內(nèi)容，也是近期內(nèi)最可能在家畜育種中得到廣泛應(yīng)用的研究項(xiàng)目。遺傳標(biāo)記是指那些可以準(zhǔn)確鑒別的、能反映個(gè)體特異性的遺傳特征。分子遺傳標(biāo)記則是指以個(gè)體遺傳物質(zhì)即核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。利用分子標(biāo)記輔助選擇育種，是現(xiàn)代動(dòng)物分子育種的一項(xiàng)主要研究?jī)?nèi)容，其直接在DNA水平上對(duì)性狀的基因型進(jìn)行選擇，因此其選種的準(zhǔn)確性大大提高，克服了傳統(tǒng)動(dòng)物育種方法的缺陷。

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是一種重要的分子遺傳標(biāo)記，它是由美國(guó)學(xué)者Lander于1996年提出的第三代DNA遺傳標(biāo)記，是基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、插入及缺失等形式。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率，相同長(zhǎng)度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。因此，可以通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)基因組是否存在SNP位點(diǎn)，并且準(zhǔn)確的鑒別SNP位點(diǎn)的基因型?，F(xiàn)在已經(jīng)公認(rèn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)可作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于育種中。該方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且檢測(cè)序列位點(diǎn)無(wú)特殊要求。

鼻胚胎促黃體激素釋放激素因子(Nasal embryonic LHRH factor，NELF)編碼基因與動(dòng)物的生殖有密切關(guān)系。Samuel D.Quaynor等通過(guò)創(chuàng)建純合NELF敲除(KO)小鼠模型，證明雌性小鼠NELF基因敲除將推遲陰道口開放，并沒(méi)有延遲第一次發(fā)情的時(shí)間，減少了子宮重量并且減少了GnRH的神經(jīng)元數(shù)目。與此相反，雄性小鼠的青春期表現(xiàn)正常。NELF敲除導(dǎo)致雌雄小鼠都表現(xiàn)為生育能力受損，平均窩產(chǎn)仔數(shù)降低。此外，越來(lái)越多的報(bào)道表明，NELF在小鼠的生殖方面有重要作用。綿羊的NELF基因定位在第20號(hào)染色體上，全長(zhǎng)5928bp，編碼區(qū)全長(zhǎng)1112bp。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)NELF基因多態(tài)性的研究主要集中于小鼠等模式動(dòng)物，而對(duì)于家畜NELF基因單核苷酸多態(tài)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用PCR-SSCP快速檢測(cè)綿羊NELF基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，從而為綿羊的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供基礎(chǔ)資料，加快中國(guó)綿羊的種質(zhì)資源改良工作。

技術(shù)負(fù)責(zé)人： 樂(lè)祥鵬 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院