技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程制藥領(lǐng)域，具體涉及一種α促黑素細(xì)胞激素的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

血管損傷，炎癥以及外傷引起的腦組織損傷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的認(rèn)知功能障礙，這類疾病嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和工作效率。目前針對(duì)上述疾病的臨床藥物大多關(guān)注腦神經(jīng)組織的修復(fù)和保護(hù)，事實(shí)上，除了神經(jīng)細(xì)胞以外，星型膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞同樣需要損傷后的修復(fù)。內(nèi)源性免疫神經(jīng)調(diào)節(jié)肽α促黑素細(xì)胞激素(α-Melanocytestimulating hormone，α-MSH)具有潛在的抗炎，神經(jīng)營養(yǎng)，抗凋亡效應(yīng)。對(duì)上述疾病具有顯著的治療潛力，而且相對(duì)于傳統(tǒng)的抗代謝免疫抑制劑副作用較小，在基礎(chǔ)研究與臨床治療中都具有重要價(jià)值，有望成為新型的神經(jīng)保護(hù)劑，是一種前景廣闊的臨床候選藥物。

α-MSH的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)經(jīng)下述途徑產(chǎn)生：(1)直接作用于外周巨噬、單核和嗜中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞上的α-MSH受體；(2)作用于腦內(nèi)神經(jīng)元上的α-MSH受體，進(jìn)而啟動(dòng)下游抗炎神經(jīng)通路；(3)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部炎癥由局部產(chǎn)生的α-MSH通過作用于中樞小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞而被抑制，也可由外周細(xì)胞產(chǎn)生的α-MSH通過腦脊液循環(huán)作用于中樞。此外α-MSH的抗炎活性已經(jīng)在多種動(dòng)物模型中被證實(shí)。這些動(dòng)物模型有刺激過敏性皮炎、接觸過敏性皮炎、血管炎、關(guān)節(jié)炎、眼部炎癥、胃腸炎、腦部炎癥以及過敏性炎癥。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中，α-MSH參與神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)通路的分子機(jī)制如下：α-MSH由其受體介導(dǎo)，降低炎癥反應(yīng)中最大的調(diào)節(jié)器分子NF-кB的介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而阻止前炎因子的釋放，抑制粘著分子的表達(dá)，從而降低腦組織損傷，起到營養(yǎng)、保護(hù)、修復(fù)受損腦組織的作用。

α-MSH主要由下丘腦,垂體和多種外周組織細(xì)胞產(chǎn)生，由13個(gè)氨基酸組成，大鼠靜脈注射體內(nèi)半衰期為幾分鐘，對(duì)于此類蛋白質(zhì)藥物來說，必須考慮腎小球?yàn)V過問題，因此，就要通過對(duì)α-MSH進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾和改造或者其他方法來延長其半衰期。

HSA是人體內(nèi)源性蛋白，分子量達(dá)66kDa，在人體內(nèi)的半衰期達(dá)到19天，具有無免疫原性、人體相容性好、無酶活等特性，是許多內(nèi)源性代謝物質(zhì)和外源性藥物的運(yùn)輸載體。上述特性使HSA成為長效蛋白/多肽類藥物開發(fā)的一個(gè)理想載體。

因此，本發(fā)明利用白蛋白融合技術(shù)(Albumin Fusion technology)將α-MSH與HSA融合，兩者之間加入具有特殊結(jié)構(gòu)的柔韌性分子接頭(連接肽)，采用本發(fā)明公開的技術(shù)方案，不僅保證了融合蛋白的穩(wěn)定性和生物活性，而且增加了分子量。

雖然現(xiàn)有技術(shù)中公開了通過融合蛋白的表達(dá)的策略可以延長目的蛋白的半衰期，但是融合蛋白的設(shè)計(jì)本身是一個(gè)程序復(fù)雜、影響因素眾多的過程，僅通過序列的簡單加和是無法實(shí)現(xiàn)α-MSH的穩(wěn)定高效表達(dá)、延長其半衰期的目的的，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

同時(shí)，為了使上述融合蛋白能夠有效地跨過血腦屏障，治療腦部炎癥及相關(guān)疾病，本發(fā)明在融合蛋白氨基酸序列中加入了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein transduction domian，PTD)，PTD是近年來發(fā)現(xiàn)的較理想的跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)載體,具有強(qiáng)大的運(yùn)載功能，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)高于自身分子量100倍的大分子，可將外源性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、化學(xué)分子、磁珠、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜，且此過程不受分子大小和種類的限制。

基于上述現(xiàn)狀，發(fā)明人公開了一種α促黑素細(xì)胞激素的融合蛋白，該融合蛋白所具有的獨(dú)特的氨基酸序列可以保證其在宿主體內(nèi)高水平穩(wěn)定表達(dá)，在保留α-MSH原有功能的同時(shí)，體內(nèi)半衰期顯著延長，同時(shí)能夠跨過血腦屏障，治療腦部炎癥及相關(guān)疾病。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種α促黑素細(xì)胞激素的融合蛋白，該融合蛋白能在宿主體內(nèi)高水平穩(wěn)定表達(dá)，半衰期長，能夠有效地跨過血腦屏障，治療腦部炎癥及相關(guān)疾病。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種α促黑素細(xì)胞激素的融合蛋白的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種重組表達(dá)載體。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種宿主表達(dá)系統(tǒng)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種α促黑素細(xì)胞激素的融合蛋白應(yīng)用。

技術(shù)負(fù)責(zé)人： 李紅玉  藥學(xué)院