技術(shù)領(lǐng)域

本實用新型涉及一種大批量禾草種帶內(nèi)生真菌鏡檢前種子一體化處理裝置，它集裝樣，軟化，洗滌，染色和加熱一體化，大大縮減了鏡檢前種子處理時間、統(tǒng)一了樣品量、強(qiáng)化了染色效果和試劑的循環(huán)利用。

背景技術(shù)

禾草內(nèi)生真菌(grass endophyte)是指在禾草體內(nèi)度過大部分或者全部生命周期，但卻不會引起禾草外部顯示任何病害癥狀的一大類真菌。從最初發(fā)現(xiàn)黑麥草(Loliumperenne)和高羊茅(Festuca arundinacea)引起家畜中毒到后來其攜帶的內(nèi)生真菌被發(fā)現(xiàn)，以及進(jìn)一步的研究證實，內(nèi)生真菌的存在不但導(dǎo)致家畜中毒而且能顯著提高宿主在群落中的競爭力，也因禾草內(nèi)生真菌的這種重要生理和生態(tài)作用，使其逐步成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，這也給內(nèi)生真菌檢測技術(shù)的發(fā)展提供了契機(jī)。目前禾草內(nèi)生真菌的檢測方法有鏡檢和分離檢測、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked Immunosorbent AssayELISA)、全基因組測序、實時熒光PCR法(Realtime PCR)和利用次生代謝物間接檢測。

1.鏡檢：(1.)用NaOH種皮軟化；(2.)用自來水洗滌；(3.)染色；(4.)鏡檢。

2.分離檢測：用酒精浸泡10min，NaClO浸泡8min，再用無菌水反復(fù)沖洗數(shù)次，用濾紙吸干后，放置PAD培養(yǎng)，內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基生長一般需要一個禮拜。

3.酶聯(lián)免疫吸附測定法：(1.)待檢標(biāo)本提取(2.)用已知特異性抗體包被固相載體；(3.)加待檢標(biāo)本，經(jīng)過溫育使相應(yīng)抗原與固相抗體結(jié)合；洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)；(4.)加酶標(biāo)特異性抗體，與已結(jié)合在固相抗體上的抗原反應(yīng)；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；(5.)加底物顯色。終止反應(yīng)后，目測定性或用酶標(biāo)儀測量光密度值進(jìn)行定量測定。

4.全基因組測序:提取菌絲DNA，再進(jìn)行測序。

5.實時PCR，該技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上加入了熒光特殊物質(zhì)來標(biāo)記產(chǎn)物，分析產(chǎn)物，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其初始濃度。

6.利用次生代謝物間接檢測：生物堿的提取，目前對于生物堿的檢測主要是運(yùn)用不同的色譜檢測方法：高效液相色譜法(HPLC)，質(zhì)譜法(MS)和氣相色譜法(GC)。HPLC檢測生物堿時需要選擇適合該生物堿分離的流動相和檢測器，不同種類的生物堿，其選擇的流動相pH值和濃度不同。

從上述可以看出，鏡檢跟分離檢測相比所需時間要短，可以大批量檢測；與酶聯(lián)免疫吸附測定法相比簡單易操作、耗時短、經(jīng)濟(jì)實惠；與全基因組測序和實時PCR相比經(jīng)濟(jì)實惠，適合大批量檢測；與利用次生代謝物間接檢測耗時短、經(jīng)濟(jì)實惠、簡單易操作。但這種簡單易操作、耗時短、經(jīng)濟(jì)實惠的方法在裝樣，軟化，洗滌，染色和加熱方面卻沒有與之相關(guān)的裝置，平時人們用離心管代替。而用離心管存在很多問題：(1.)裝樣時，沒有參考標(biāo)準(zhǔn)，因人而異，造成種子的浪費(fèi)和軟化，染色的不徹底。(2.)用NaOH對禾草種子進(jìn)行軟化處理后，需要將軟化液吸取干凈，由于針管頭細(xì)小，在吸取過程容易造成針管堵塞，需要多次反復(fù)吸取，耗費(fèi)大量的時間。(3.)由于禾草種子小，在洗滌時會使部分種子外流，造成浪費(fèi)，同時需要反復(fù)清洗，盡量把NaOH溶液清洗干凈，否則會對染色造成影響，這個過程對大批量的禾草種子來說顯得異常繁瑣和浪費(fèi)時間。(4.)染色時需要加熱，需要把離心管移到水浴鍋中加熱，在過程中可能混淆和洗掉原先的標(biāo)記，造成實驗的失敗，同時要把染色完的試劑倒掉，造成試劑的浪費(fèi)，對環(huán)境造成一定的污染。

實用新型內(nèi)容

為了解決上述裝置中存在的問題，本實用新型提供了一種集裝樣，軟化，洗滌，染色和加熱的禾草種帶內(nèi)生真菌鏡檢前種子一體化處理裝置，大大縮減了鏡檢前種子處理時間、簡化了其軟化液和洗滌液的吸取過程。

技術(shù)負(fù)責(zé)人： 陳振江 ; 李春杰   草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院